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四维杂交反应试剂

背景知识：
PCR技术已经在临床广泛应用，TaqMan探针定量PCR技术也已经成为临床最常用的核酸检测技术。但是，（a）由于临床的样本中成份非常复杂，而目前临床核酸提取方法不是很完善，由其提取的总核酸包罗各种序列的DNA或RNA；(b)成品PCR试剂盒往往是按照纯净的单一序列DNA经优化实验得到的，其特异性是由两段引物和一个探针共三段特异核酸序列保证（针对TaqMan探针试剂）；(c)传统杂交技术（Southern、Northern等）在杂交温度有偏差时，其特异性无法得到保证，会有一、二个碱基错配的核酸杂交对存在。如果临床样本中恰好存在与TaqMan试剂中三段核酸序列同源、近源（差错一、二个碱基）或具有简并能态的核酸序列，TaqMan探针定量PCR的检测结果中就会存在非特异假阳性反应信号或者定量不准确（多重PCR的竞争性）的情况；（d）如果试剂盒没有采用批批检测作为质控，Taq酶的特异性活性由于运输和储存原因而无法保证，则对于低浓度临床样本（浓度<1000或10000拷贝，即Ct>33时），非常容易出现非特异假阳性信号；（e）Taq酶中可能含有核酸杂质链。四维杂交技术是在传统杂交（或三维杂交，XYZ是表征DNA片段长度，碱基组成和碱基排列）的基础上引入温度作为第四个参数的核酸分子杂交技术。它是在四维温度空间里来描述杂交结果的特异性质。传统概念中，TaqMan探针模式是不能做熔解曲线分析。但是，使用四维杂交反应试剂后，TaqMan探针模式就可以做熔解曲线分析。四维杂交反应试剂中含有独特的专利成份，其测量结果稳定可靠，再重复性好，有助于分析所获得阳性信号的性质（特异性的或非特异性的）。

四维杂交反应试剂使用说明：
在Taqman探针模式定量程序做完后，再加热（98度）5分钟将酶灭活，等毛细管冷确到2－8度，离心后打开盖子，加入1-1.2uL(20x)四维杂交绿液（4DH-Green(540nm)），管盖上有“4DHG”标记，用之前需涡旋混匀；然后重新盖上盖子，离心后，按下列程序在LightCycler 仪器上做温度扫描获得特征熔点曲线：
95度6分；30度6分；95度0秒0.2度/秒，采集数据选“cont”；40度30秒。

在其他实时荧光PCR系统，如eppendorf的realplex系统（塑料管）和Lightcycler 480系统(96或384孔板)同样可按比例加四维杂交反应试剂做相应分析。

结果分析：
（1） 选适当的“Cº to Average”值，将阳性质控品(或标准品)的特征熔点Tmp值（用“Manual Tm”手调）确定。
（2） 比较样品中是否含有与阳性质控品(或标准品)的特征熔点Tmp值相同的峰，如果只有一个峰值与阳性质控品的特征熔点Tmp值在±1.0ºC范围内（可以看成同一个峰），则说明PCR反应的特异性比较好，TaqMan探针模式定量的结果准确性很高；如果一个峰值与阳性质控品的特征熔点Tmp值相距大于2.0ºC，则说明是非特异假阳性信号峰值；如果有多个峰，则说明PCR反应的特异性不好，有非特异假阳性信号成份存在，TaqMan探针模式定量的结果准确性不可靠；如果一个峰值与阳性质控品的特征熔点Tmp值相距在1.0-2.0ºC间，说明特异性信号成份和非特异性信号成份同时并存，TaqMan探针模式定量的结果存在一定量的误差。

保存：避光。长期保存在－20 度，有效期可达一年。反复冻融不超过8次。2~8度保存不超30天。
包装：100次反应/管（120uL）。 运输条件：避光、室温（10天内）。
备注： 为了避免可能发生的污染情况，可以采用将4DHG试剂预先存放于盖子中的方法或冻干于盖子上的方法。当PCR扩增完后，进行适当方式离心，将4DHG与PCR扩增产物混匀之后，再进行四维杂交分析。SYBR Green I 模式和双杂交探针模式，最好也在扩增完后，加入四维杂交4DH液（不含Green 染料），温度扫描得到的特征熔点Tmp值更好，更稳定，单管测量过程可再三重复（反应管存放于避光—20度处，可在一年内再次重复测量）。四维杂交液不可直接用于PCR扩增反应！本试剂盒仅用于研究，不用于临床诊断。

另外，应用四维杂交液可通过测定引物和探针的特征熔点温度Tmp而迅速获得稳定最佳扩增条件，从而在极短时间内开发出全新PCR试剂盒。

背景知识：
由于量子力学方程无解析解，因此引物和探针的熔点温度是无法确定计算出的。现有的引物和探针设计程序，无论是用多么好的计算方法，无论是用多么快的计算机，也只能得出估算值。所以真实的熔点温度值（Tmp）只能用测量得到。

引物和探针的特征熔点温度Tmp测定

取引物人工合成的冻干粉，用PCR级水或4DHD（四维杂交稀释液）配成50uM浓度。与引物互补序列寡核酸单链也配成同样浓度溶液。取PCR级水14uL，加入1uL将要做PCR反应的缓冲液（20x）或4DHB（四维杂交缓冲液），加入1uL四维杂交4DHG液，加入引物溶液2uL并加入互补序列单链溶液2uL，最后总体积为20uL。用20uL玻璃毛细管，在LightCycler上做熔解曲线扫描：
在95ºC保持6分钟；降至30ºC保持6分钟；95度0秒0.2度/秒，采集数据选“cont”；40度30秒。
测定一个引物的Tmp值后，再测另外一个反向引物的Tmp值。如果两个引物的Tmp值有较大差距，重新合成引物及互补序列单链，再重测Tmp值，直到满意为止。探针的Tmp值可以同样测量。
测定Tmp值后，可将PCR的退火（杂交）温度设为Tmp—20ºC，保留10秒；延伸温度设为Tmp—5ºC，保留时间按25碱基/秒速度，根据扩增链长度算出，可适当增加10~15秒。PCR过程完成后接着扫熔解曲线，观察分析熔解曲线，如有非特异信号峰存在，可适当提高退火温度+5ºC。即要保证无杂信号峰出现，又要有足够的产出率，直至最佳状态。
加TaqMan探针应当在用SYBR Green I荧光染料获得最佳稳定PCR扩增状态之后，将SYBR Green I荧光染料用TaqMan探针替换。

四维杂交技术特点
四维杂交技术的再重复性要远远优于传统三维杂交技术。这里指的再重复性是指不同时间之间的重复性、不同地点之间的重复性、不同操作者之间的重复性和不同种类反应之间的重复性，而不是单指同一时间、同一地点、同一操作者和同一种反应之间的可重复性，即此处指的再重复性是指客观规律的可重复性。某个病人样本反应管做PCR反应的过程是不可重复的，但是，某个病人样本反应管做四维杂交反应的过程是可以再三重复的，而且冷冻保存一年后，仍然可以用此管重复出与原来一样结果的四维杂交反应的过程。传统三维杂交技术（包括Southern、Northern和原位杂交）是做不到这点的。



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